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陈兆欢段然黄晓璐李青峰 摘要 目的探索富半胱氨酸蛋白61即CCN家族成员1(CCN1)对自体脂肪移植术后脂肪组织存活的影响及其作用机制。方法建立大鼠自体脂肪移植模型1周后，随机分为CCN1组与对照组，每组各20只。比较两组大鼠移植脂肪存活情况;比较两组大鼠移植脂肪组织形态、活性脂肪细胞比例及新生血管数量;利用高通量测序技术比较两组大鼠移植脂肪组织差异表达信使核糖核酸(mRNA)并进行聚类分析;比较两组大鼠移植脂肪组织促炎因子的表达水平。结果与对照组比较，CCN1组脂肪组织质量保留率较高，差异有统计学意义(P0.05)，CCN1组脂肪细胞完整性更高，囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度和纤维化程度更低，差异均有统计学意义(均为P0.)。免疫荧光染色结果显示，CCN1组中活性脂肪细胞比例更高且形态均一，对照组存在较少的活性脂肪细胞且大小不一，伴有囊泡化现象。与对照组比较，CCN1组新生血管数量更多，血小板衍生生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)mRNA表达水平均升高，差异均有统计学意义(均为P0.05)。高通量测序结果显示两组的转录组水平差异有统计学意义，CCN1组中与M1型巨噬细胞相关的细胞表面标志物、炎症因子及趋化因子基因表达呈下调趋势，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)结果显示CCN1组白细胞介素(IL)-8、IL-1和Toll样受体(TLR)2mRNA表达水平较对照组均降低，差异均有统计学意义(P0.01~0.05)。结论在自体脂肪移植过程中添加外源性CCN1能有效促进脂肪组织新生血管化，提高移植脂肪存活率，其机制可能是通过下调TLR2表达介导巨噬细胞向M2型转化。 2.结果 2.1两组大鼠自体移植脂肪的存活情况 在大鼠自体脂肪移植模型中，CCN1组大鼠移植脂肪组织质量保留率为(50±3)%，高于对照组的(35±4)%(P0.05，图1)，表明大鼠自体移植脂肪存活率在CCN1干预下有较明显的提升。2.2两组大鼠自体移植脂肪组织的形态 光学显微镜下观察大鼠移植脂肪组织HE染色切片，从脂肪细胞完整性、囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度以及纤维化程度4个角度评价移植脂肪组织的形态与活力(图2)。与对照组比较，CCN1组脂肪细胞完整性更高，囊泡化与空泡化程度、炎症细胞聚集程度和纤维化程度更低，差异均有统计学意义(均为P0.)。2.3两组大鼠自体移植脂肪组织的活性脂肪细胞比例 对脂肪组织切片进行免疫荧光染色，采用perilipin标记具有活性的脂肪细胞。CCN1组中活性脂肪细胞较多且形态均一、结构完整，对照组存在较少的活性脂肪细胞且大小不一，伴有囊泡化现象(图3A)。每个样本随机选取5个视野对perilipin染色面积比例进行统计比较，与对照组比较，CCN1组perilipin染色面积比例更高，差异有统计学意义[(7.9±1.9)%比(10.2±2.1)%，P0.01，图3B]，表明CCN1组活性脂肪细胞比例更高。2.4两组大鼠自体移植脂肪组织的新生血管数量 为进一步探究CCN1促进大鼠自体脂肪移植存活的机制是否与新生血管的增加有关，对脂肪组织切片进行免疫荧光染色，采用CD31标记新生血管内皮细胞(图4A)。每个样本随机选取10个视野对CD31阳性内皮细胞数量进行统计比较，CCN1组较对照组中CD31阳性的内皮细胞数量更多，差异有统计学意义[(10.2±3.1)个比(6.9±1.9)个，P0.05，图4B]，提示CCN1组新生血管数量更多。为进一步验证CCN1在移植脂肪组织中新生血管化的作用，通过RT-qPCR检测脂肪组织中PDGF、FGF和VEGFmRNA表达水平(图4C)。结果显示，与对照组比较，CCN1组PDGF和FGFmRNA水平均升高，差异均有统计学意义(均为P0.05)，VEGFmRNA差异无统计学意义(P0.05)。2.5两组大鼠自体移植脂肪组织差异表达mRNA聚类分析 为探究CCN1影响大鼠自体脂肪移植存活的内在机制，本研究将CCN1组与对照组的大鼠自体移植脂肪组织提取总mRNA进行转录组高通量测序，并对测序结果进行分析。测序结果显示两组的mRNA表达水平差异有统计学意义，共鉴定出个差异表达基因，包含个上调基因和个下调基因。其中与M1型巨噬细胞相关的细胞表面标志物[细胞因子信号传导抑制剂3(suppressorofcytokinesignaling3，SOCS3)、TLR2、TLR7、TLR9、IL-18受体辅助蛋白(IL-18receptoraccessoryprotein，IL-18RAP)、炎症因子及趋化因子[IL-1β、肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(tumornecrosisfactoralphainducedprotein3，TNF-αIP3)、IL-23α、IL-6、IL-18、CC趋化因子配体(CCchemokineligand，CCL)3、CCL4、CXC趋化因子配体(CXCchemokineligand，CXCL)1、CXCL2、CXCL6]基因表达均呈下调趋势(表1)，提示CCN1干预可能抑制移植自体脂肪组织中的巨噬细胞表型向M1表型转化。2.6两组大鼠自体移植脂肪组织促炎因子的mRNA表达水平 为进一步验证高通量测序结果，采用RT-qPCR检测两组大鼠移植脂肪组织促炎因子的mRNA表达水平(图5)。与对照组比较，CCN1组IL-8、IL-1和TLR2mRNA表达水平均降低，差异均有统计学意义(P0.01~0.05)，IL-6mRNA表达水平略降低，但差异无统计学意义(P0.05)。以上为本文主要结果，全文请查看《器官移植》杂志年第4期-页或点击文末原文链接。 作者单位：上海交通大学医医院整复外科 通信作者：黄晓璐，研究方向为器官修复重建与再生，Email：xl_huang alumni.sjtu.edu.cn李青峰，博士研究生导师，教授，研究方向为器官修复重建与再生，Email：dr.liqingfeng yahoo. |
